METODOLOGIAS DE ANALISIS FOLIAR

Por: Felipe Calderón Sáenz y Margarita Pavlova
Dr. Calderón Laboratorios Ltda., Junio 27 de 2001; Rev. Marzo 27 de 2004
www.drcalderonlabs.com
Avda. 13 No. 87-81
Bogotá D.C., Colombia S.A.
acaldero@cable.net.co

Diagrama General
Preparacion de la Muestra
Digestión Húmeda
Determinación de K - Ca - Mg
Determinacion de Sodio
Determinación de Fósforo
Determinación de los Elementos Menores Fe, Mn, Cu y Zn.
Determinación del Boro por el Método de la Azometina-H.
Determinación del Boro por el Método de la Quinalizarina.
Determinación del Azufre
Determinación del Nitrógeno
Determinación del Aluminio en Tejido Vegetal

Preparación de la Muestra.

Las muestras que llegan al laboratorio se somenten al siguiente proceso de preparación.

1.  Limpieza de la muestra:  La muestra fresca si contiene polvo o vestigios de contaminación se lava con abundante agua destilada, y se deja secar un poco al aire.
2.  Secado de la muestra: Se toma una cantidad de muestra de aproximadamente 100 grs, y se somete a un secado en estufa durante 24 a 48 horas a una temperatura entre 60 y 80°C.
3. Molienda. Una vez seca la muestra, se muele y homogeniza en molino de cuchillas, se pasa por un tamiz plástico de 2 mm y se almacena para posterior análisis.
4.  Almacenamiento:  Las muestras se almacenan en bolsas plásticas exentas de humedad, quedando listas para análisis químico.

Nota:  Siempre se deben preparar en el laboratorio laboratorio muestras patrón para Control de Calidad Analítico.

Digestión Húmeda

La muestra seca y molida se somete a una digestión húmeda donde se efectúa la liberación de los elementos minerales ( P, K, Ca, Mg, S, Mn, Cu, Fe, Zn y Na ) esta digestión se hace con una mezcla de HNO₃ concentrado del 65% y HClO₄ concentrado del 70%.  (250 ml HNO₃ + 100 ml HCLO₄) Relación de Mezcla 2.5 : 1

1.  Procedimiento:  Se pesan 0.5 gramos de muestra seca y molida, se lleva a un tubo de ensayo de 2.5 cm de diámetro x 35 cm de altura, se agrega de 2.5 a 3.0 mls de mezcla acida dependiendo del cultivo, luego se coloca en la placa de digestión. (La temperatura no debe pasar de 200°C a mayor temperatura se puede volatilizar algo del Fósforo). Se toma como punto final de la digestión cuando aparecen humos blancos y ya el digerido se encuentra totalmente transparente. En este punto deben haber aproximadamente 0.5 mililitros de solución. Se deja enfriar, se agregan 24.5 mls de agua destilada, se filtra en papel de filtro cuantitativo (Whatman 40 o similar). En este filtrado se encuentran listos para lectura el P, S, K, Ca, Mg, Mn, Cu, Fe, Zn y el Na. El residuo contiene los materiales insolubles y la Sílice cruda (SiO2). De este filtrado se toman las alicuotas correspondientes para el análisis químico.

Las determinaciones de Cu, Mn, Fe, Zn y Na, se realizan directamente del filtrado de la digestión.
La determinación de Fosforo (P) se hace por Colorimetría.
La determinación de Azufre (S) se hace por turbidimetría con Cloruro de Bario.
La determinación de Boro (B) se hace por Colorimetría con Azometina-H.
La determinación de Nitrogeno (N) por Kjeldhal directamente de la muestra inicial.

Determinación de K - Ca - Mg

Del filtrado de la digestión se toman 0.5 ml, se le agregan 48.5 ml agua destilada y 1 ml  de Oxido de Lantano al 5%. De esto resulta una relación de Dilución de 50/0.5 ml, se agita y se lee en el espectrofotómetro de absorción atómica.

Cálculos

Ca  = (ppmCa x 25 x 50 x 100)/(10E6 x 0.5 g x 0.5)  = ppm Ca x 0.5

%Mg = (ppmMg x 25 x 50 x 100) / (10E6 x 0.5 g x 0.5)  = ppm Mg x 0.5

 Reactivos y Equipos

Solucione Patrones Primarios de K , Ca, Mg, de 1000 ppm.

Para K :  Se pesan 2.2283 gramos de K₂SO₄ y se disuelven en aprox. en 200 ml de agua destilada.
Para Ca:  Se pesan 2.4972 gramos de CaCO3 y se disuelven en aprox 50 ml de agua destilada, se agrega HCL 6 N en una mínima cantidad hasta disolución completa y se agrega 200 ml de agua destilada.
Para Mg :  Se pesan 8.8213 de (CH3COO)2 Mg.4H2O) y se disuelven en 200 ml de agua destilada.
Finalmente se mezclan estas tres soluciones y se afora a 1 lt con agua destilada, quedando un patrón mixto de K, Ca, Mg, de 1000 ppm de c/u.

Patrones secundarios

Se preparan patrones de trabajo de 0.25 , -0.5, 1, 2, 4, 8, 16 ppm de K, Ca, Mg:  Se toma la alicuota correspondiente, se adiciona 2 mls de solución de Oxido de Lantano, ay se afora a 100 mls con agua destilada.

 Equipos

Espectofotometro de absorción Atómica.

-  Vasos de precipitación de 100 mls
-  Balones de 1 litro
-  Varillas de vidrio
-  Tubos de digestión
-  Plancha para digestión
-  Pipetas 0.5-1-2  10 mls

Determinación de Sodio.

El Sodio se determina por lectura directa en el fitrado obtenido de la digestión húmeda por el método de emisión de llama.

- Cálculos:
ppm de Na= (ppm leidas Na x V. aforamiento) / (gr de muestra)  = ppm leidas x 25 /0.5 = ppm leidas de Na x 50

- Reactivos:
- Patrón primario de Na de 1000 ppm: Se pesan 2.5420 gms de NaCl y se aforan a 1 litro con agua destilada.
-  Patrones secundarios: A partir del patrón primario, se preparan patrones de 2, 4, 10, 20, 40, 80 ppm aforados a 100 mls en mezcla acida.
-  Mezcla acida:  Se prepara una mezcla de H2SO4 al 0.025 N y HCL al 0.05 N.

Determinación de Fósforo.

El método utilizado es el de Molibdato-Vanadato de Amonio dando lugar a la formación de un complejo de color amarillo.

-  Procedimiento: Se toma una Alícuota de 0.5 ml del filtrado de la digestión, se agregan 2 ml de agua destilada y 1 ml de la solución Molibdato-Vanadato de Amonio, desarrollándose inmediatamente el color amarillo, se deja 5 minutos en reposo, y se lee a una longitud de onda de 430 nm.

- Para los patrones se procede de igual manera que para las muestras, tomándose 2.5 de cada patrón + 1 ml de la solución Molibdato-Vanadato de Amonio.

- Cálculos:

Constante K =  Concentración / Absorbancia

% P= K x abs x V. Aforamiento x Alícuota x 100 / ( 10 (6)  x 0.5 gramos x 0.5)  = K x abs x 0025

Reactivos y Equipos

Molibdato de Amonio (NH₄)₆ Mo₇ 0₂₄. 4H₂O al 5% (Solución A)  se pesan 12.5 gramos de Molibdato de Amonio, se agrega 150 mls de agua destilada, se calienta suavemente hasta completa disolución y se afora a 250 mls.

Vanadato de Amonio NH₄VO₃ 0.25% (Solución B) se pesan 0.625 gramos se agrega 125 mls de agua destilada, se agrega 62.5 ml de HNO₃ consentrado, se deja enfriar y se afora a 250 mls.

En un balón de 500 mls se disuelve Solución A (Molibdato de Amonio)  sobre solución B (Vanadato de Amonio) en una proporción 1 : 1.

Solución Patrón de Primario de P (100 ppm). Se pesan 0.439 gramos de KH₂PO₄, se agregan 300 mls de agua destilada y 10 ml de H₂SO₄ 10 N y se afora a 1 litro con agua destilada.

Acido sulfurico 10 N (H2SO4);  A partir de H2SO4 %, d = 1,84 se toman 280.31 gr y se aforan a 1 litro con agua destilada.
 
-  Soluciones Patrones Secundarios:

A partir del patrón primario, se preparan patrones de 3 - 5 - 8 ppm y se aforan a 100 mls con agua destilada.

Colorímetro
Vasos de precipitación
Tubos de ensayo
Pipetas

Determinación de los Elementos Menores Fe, Mn, Cu y Zn.

Del filtrado obtenido en la digestión húmeda se lee directamente por absorción Atómica :  Cu, Mn, Fe, y Zn.

Cálculos

ppm totales = ppm leidas x V aforamiento / gr de Muestra

ppm Cu = ppm Cu leidas  x 25 / 0.5  =  ppm Cu leidas x 50
ppm Mn = ppm Mn leidas x 25 / 0.5  =  ppm Mn leidas x 50
ppm Fe = ppm Fe leidas   x  25 / 0.5  =  ppm Fe leidas x 50
ppm Zn = ppm Zn leidas   x 25 /0.5   =  ppm Zn leidas x 50

Reactivos y Equipos

Patron Primario Mixto de Cu - Mn - Fe - Zn  de 1000 ppm

Para Cobre:  Se pesa 1 gramo de Cobre metálico en un volumen minimo de HNO3 realción 1 : 1 y se diluye en 200 mls de agua destilada.

Para Manganeso: Se pesan 3.076 gr de Sulfato de Manganeso  MnSO₄ . H₂O diluyendo en 200 mls con agua destilada.

Para Hierro: Se pesan 7.016 gr de Sulfato Ferroso Amonico (NH4)₂ Fe (SO₄)₂. 6 H₂O diluyendose en 200 mls de agua destilada.

Para Zinc :  Se pesan 100 gramos de Zinc matálico en una cantidad minima HCl relación ( 1 : 1 ) diluyéndose en 200 mls con agua destilada.

Preparadas estas soluciones se mezclan y se aforan a 1 litro con agua destilada quedando el patrón primario mixto de 1000 ppm de Cu, Mn, Fe, Zn.

Patrones secundarios:

A partir del patrón primario se prepara un patrón primario de 100 ppm que se afora a 1 litro con agua destilada y a partir del patron de 100 ppm se preparan patrones secundarios de 0.5, 1-2-4-8-16 y 32 ppm aforándose a 100 mls con mezcla acida.

- Mezcla Acida:  Se prepara una mezcla de H2SO4 al 0.25 % y HCl al 0.05 %.

-  Equipos:
Espectofotometro de absorción Atómica.
Balones volumétricos de 1 litro
Vasos de precipitados
Pipetas
Varillas de vidrio

Determinación del Boro Foliar por el Método de la Azometina-H.

Se pesan 0.5 gramos de muestra seca y molida. Se hace digestión con mezcla acida HNO3 - HClO4 después de la digestión se afora a 25 mls con H2O destilada y se filtra.

Del filtrado se toman 0.5 ml, se agrega 5 ml del reactivo del desarrollo de color y se deja reposar durante una hora a temperatura ambiente. Se lee en el colorimetro a 420 mm.

Reactivos

Solución patrón primario de Boro 100 ppm:  Se disuelven 0.5716 gramos de H₃BO₃ en agua destilada aforando a un litro manteniendolo en una botella plastica.

Patrones Secundarios

Se preparan a partir del patrón de 100 ppm, patrones de 2.5, 5.0, 7.5 10 y 15 ppm aforando a 100 mls con HCl al 1%.  Estas soluciones son estables.

Solución Azometina H

Se disuelven 0.9 gramos de Azometina H y 2 gramos de Acido Ascorbico en 100 mls de agua.  Se guarda la solución en la nevera y gastarla antes de 14 días.

Solución Reguladora

Se disuelven 140 gramos de CH3 COONH4, 10 gramos de CH3 COOK, 4 gramos de sal Disodica del Acido Nitrilotriacetico al 99%, 10 gramos  del acido Etilendinitrilo tetraacetico y 350 mls al 10% v/v de Acido Acetico y diluir con H2O a 1 litro. Esta solución es estable.

Reactivo Desarrollo Color

Tomar 35 mls del reactivo de Azometina H y 75 mls de la solución reguladora en un balón de 250 mls y se afora con H2O destilada.

( Este reactivo se prepara en el momento de trabajo).

Calculos:

Determinación del Boro Foliar por el Método de la Quinalizarina.

Principio del método:

Este método de análisis del Boro se realiza en tres (3) etapas:

a) Mineralización de  la muestra por via seca mediante una calcinación a una temperatura de 550°C.
b) Extracción del Boro con H2SO4  5N.
c) Colorímetria con Quinalizarina (1,3,5,8 Tetrahidroxi-Antraquinona)  formando un complejo de color Violeta (Lila).

Procedimiento:

Se pesan 0.5 gramos de muestra seca, se lleva a un crisol de porcelana y se empieza la calcinación en una mufla hasta obtener cenizas blancas o grises dependiendo del cultivo, se deja enfriar, se diluye con 10 ml de H2SO4 5N, se calienta hasta comienzo de los primeros hervores, se deja reposar durante 1 hora y se filtra ( papel filtro Whatman 40).  Del filtrado se toman 0.5 ml, se agregan 5 mls del reactivo de Quinalizarina, se agita, se tapa y se dejan en cuarto oscuro durante 20 minutos, luego se hace lectura de Boro en el Colorímetro a una longitud de onda de 620 nm.

De igual manera se procede con los patrones y el blanco.  Se utilizan patrones de 2-4-6 ppm. Par el blanco se toma 0.5 mls de H2SO4 5N + 5 mls de reactivo de Quinalizarina

Cálculos:

ppm B = ppm leidas x volumen de aforamiento / (gr de Muestra)  =  ppm leidas x 10 / 0.5   = ppm B leidas x 20

Las ppm de Boro leidas se obtienen mediante la curva donde se grafica concentración de los patrones versus sus absorbancias respectivas.

Reactivos y Equipos:

-  Acido Sulfúrico Concentrado H2SO4 (Grado reactivo) 95 - 96 %
-  Acido Sulfúrico H2SO4 5N se toman 140,16 mls de Acido Sulfúrico concentrado del 95 % de d=1.84 aforandose a 1 litro con agua destilada.

Reactivo de Quinalizarina:

C₁₄ H₈ O₆ 10 miligramos/litro:  Se pesan 0.01 gramos de Quinalizarina aforándolo a 1 litro con Acido Sulfúrico concentrado  (H2SO4).

Patrón Primario de Boro de 100 ppm

Se pesan 0,572 gramos de Acido Borico (H3BO3) y se afora a 1 litro con agua destilada.

Patrones Secundarios:

Se preparan a partir del patron primario patrones de 2 - 4 - 6 ppm afórandose  a 100 mls con Acido Sulfúrico 5N ( H2SO4 5N ).

Equipos:

-  Colorímetro
-  Tubos Coleman libres de Boro.
-  Crisoles de porcelana
-  Mufla
-  Pipetas
-  Vasos de precipitado
-  Varillas de vidrio
 

Determinación del Azufre

El Azufre se determina por turbidimetría con Cloruro de Bario (BaCl2) al 10% y Glicerina, directamente del filtrado obtenido de la digestión húmeda.

Procedimiento

Se toma 1 ml del filtrado + 4 mls de agua destilada, + 2 mls de solución de (BaCl2 /Glicerina), se agita y se lee en el colorímetro a una lóngitud  de onda de 800 nm.

Para los patrones se procede de la misma manera que con las muestras.

Cálculos:

CteK = Concentración patrones /Absorbancia
% S = CteK x Absorbancia x V. Aforamiento x 100 / Gramos de muestra
% S = CteK x Absorbancia x 25 x 100 /10⁶  x  0.5
% S = CteK x Absorbancia x 0.005
 

Reactivos y Equipos

Cloruro de Bario al 10% (BaCl₂)

Se toman 100 gramos de Cloruro de Bario y se afora a un litro  con agua destilada.

Solución de Glicerina-Cloruro de Bario

Se toman 500 mls de BaCl2 al 10%, se agregan 250 mls de Glicerina, se agita y se afora a un litro con agua destilada.

Patrón primario de S de 1000 ppm

Se pesan 4.1195 gramos de Sulfato de Amonio (NH4)2 SO4 y se afora a un litro de agua destilada.

Patrones Secundarios

A partir del patrón primario se preparan patrones de trabajo de 40, 60, 80 y 120 ppm aforando la respectiva cantidad a 100 ml con agua destilada.

Equipos

-   Colorímetro
-   Agitador magnético
-   Pipetas
-   Balones volumétricos
-   Tubos de ensayo
 

Determinación del Nitrógeno

Metodo Micro-Kjeldhal (Rev. Dic/2000)

El método utilizado es el de Micro-Kjeldhal mediante una digestión del tejido vegetal con H₂SO4 concentrado utilizando como catalizador una mezcla propietaria de Sulfato de Cobre, Sulfato de Sodio anhidro, Yeso y Caolín para controlar la espuma y la la temperatura de ebullición. Ver en la parte corrspondiente a la preparación de reactivos.

Marcha analítica

Digestión

Se pesan 0.25 gramos de muestra seca, se lleva a un tubo de digestión Kjeldhal de 25 x 300 mm, se agrega 2.5 gr de Catalizador (aprox. una cucharadita de 2.5 ml ), se agregan 8 ml de H2SO4 concentrado, se coloca en la placa de calefacción y se empieza la digestión a 340° C, hasta que el digerido tome un color claro azul verdozo. Se deja enfriar.

Destilación

Se traslada el digerido, el cual despues del enfriamiento puede quedar parcialemte sólido, a un tubo de destilación de 250 ml, mediante ayuda con 25 ml de agua. Acto seguido se inicia el procesio de destilación en arrastre con vapor, aplicando 25 ml de agua y 65 ml de solución de hidróxido de Sodio (Soda Cáustica) al 40 %.

Se recibe el destilado en un recipiente que contiene 50 ml de solución de Acido Bórico al 4 % con Indicador Mixto.

Se termina cuando en el recipiente se ha completado un volúmen de 100 mls del destilado, el cual se valora con H₂SO₄  1/7 N.

Calculos

1 ml de H2SO4 N/7 neutralizan 2 meq de NH₄
 
  
N= V. H₂SO₄ x 2 x 100/grs de muestra x 1000

gramos de muestra = 0.25 gramos

Observación:  Siempre se hace un blanco de H₂SO₄ con el que se hace la digestión.

Reactivos Equipos

-   Acido Sulfúrico Concentrado.
-   Sulfato de Sodio Anhidro Na2SO4.
-   Acido sulfúrico N/7: Se toman 3,97 mls de Acido Sulfúrico y se aforan a 1 litro con agua destilada.
-   Sulfato de Cobre (CuSO4.5H2O)
-   Hidroxido de Sodio NaOH (40%) se pesan 400 gramos de NaOH, se disuelven y aforan a 1000 ml con agua destilada.
-   Acido Bórico H3BO4 (al 4% ) se pesan 40 gramos de H3BO4, se disuelven y aforan a 1 litro con agua destilada. Antes de aforar se agregan 40 gotas de NaOH al 1% y 160 gotas de indicador mixto (Rojo de Metilo y Verde Bromocresol).

Catalizador:

- Sulfato de Sodio Anhidro ................ 1000 gr
- Sulfato de Cobre Pentahidratado ..... 50 gr
- Yeso .............................................. 100 gr
- Caolín ............................................ 100 gr

Indicador Mixto:

- Se pesa 0.5 gr de Verde Bromocresol y 0.1 gr de Rojo de Metilo y se disuelven en 100 ml de Etanol.

Hidroxido de Sodio al 1%: Se pesa 1 gramo de NaOH y se afora a 100 mls con agua destilada.

Equipos

- Equipo Kjeldhal
- Vasos de precipitado de 250 mls
- Tubos de Digestión de 25 x 300 mm
- Tubo Kjeldhal de 250 mls
- Pipetas de 25 mls
- Buretas
- Probetas

Metodo Semi-Micro Keldhal

Marcha analítica

Digestión:

Se pesan 0.5 gramos de muestra seca, se lleva a un balón de digestión Kjeldhal de 250 ml, se agrega 20 mls de H2SO4 concentrado, de 0.5 a 1 gramo de Catalizador, se coloca en la placa de calefacción y se empieza la digestión, hasta que el digerido tome un color claro azul verdozo. Se deja enfriar.

Destilación

Se añade 130 mls de agua destilada, y 70 mls de NaOH al 40%, dos a tres granallas de Zinc y se inicia la destilación. Se termina cuando el recipiente que contienen 25 mls de H3BO4, se han recibido 100 mls del destilado, el cual se valora con H2SO4 1/7 N.

Cálculos 1 ml de H2SO4 N/7 neutralizan 2 meq de NH4 N= V. H2SO4 x 2 x 100/grs de muestra x 1000 gramos de muestra = 0.5 gramos

Observación: Siempre se hace un blanco de H2SO4 con el que se hace la digestión.

Reactivos:

- Acido Sulfúrico concentrado.
- Sulfato de Sodio Anhidro NaSO4.
- Acido sulfúrico N/7: Se toman 3,97 mls de Acido Sulfúrico y se aforan a 1 litro con agua destilada.
- Granallas de Zinc.
- Sulfato de Cobre (CuSO4.5H2O)
- Hidroxido de Sodio NaOH (40%) se pesan 40 gramos de NaOH, se disuelven y aforan a 1000 ml con agua destilada.
- Acido Bórico H3BO4 (al 4% ) se pesan 40 gramos de H3BO4, se disuelven y aforan a 1 litro con agua destilada. Antes de aforar se agregan 40 gotas de NaOH al 1% y 160 gotas de indicador mixto ( Rojo de Metilo y Verde Bromocresol).
- Indicador Mixto: Se prepara con verde Bromocresol al 0,25% y rojo de metilo al 0,05% en Etanol.
- Hidroxido de Sodio al 1%: Se pesa 1 gramo de NaOH y se afora a 100 mls con agua destilada.

- Catalizador: 5 grs de Sulfato de Sodio Anhidro mas 0.5 gr de Sulfato de Cobre.

Equipos:

- Equipo Kjeldhal
- Vasos de precipitado de 250 mls
- Balones Kjeldhal de 250 mls
- Pipetas de 25 mls
- Buretas - Probetas  

Determinación del Aluminio en Tejido Vegetal

Se toman 0,5 gramos de muestra seca, se hace digestión en mezcla acida ( HNO3+ HClO4 ). Una vez hecha la digestión se afora a 25 mls de agua destilada.

Procedimiento

Del filtrado se toma 1ml de muestra, se agrega 9 mls de agua destilada, 0,5 nm después de haber estado 40 minutos en reposo.

Patrones:  Se toman 10 mls de cada patrón y se procede de igual manera que en las mustras.

Se utilizan patrones de 0.5, 1.0, 2.0 y 4 ppm

Cálculos:
            V.af x K. Abs       25 x K x Abs
  ppm Al =  -------------- =   -------------  =  K x Abs x 50
            grs muestra             0,5

V af   =   Volumén aforamiento
K      =   Constante (» concentración patrones )
Abs   =   Absorbancia
gr   =   Gramos muestra.